液滴微流控技术为单细胞水平的生物和化学筛选提供了一种高通量方法。利用液滴微流控技术的平台，在蛋白质工程、单细胞测序、单分子检测和纳米粒子合成等领域已经取得了重要进展。尽管如此，液滴微流控技术的应用仍主要局限于商业设备中的小众应用或专家使用。其主要障碍之一是聚二甲基硅氧烷（PDMS）器件对光刻制造技术的依赖。虽然表面特性和制造分辨率使此类器件成为大多数应用的理想选择，但缓慢的设计周期以及对无尘室的需求限制了它们的广泛应用。此外，浇注、固化、打孔和粘合器件等手工过程，也影响了PDMS器件的可扩展性，限制了其商业潜力。直接采用商业化热塑性塑料制作微流控器件原型，可减少放大过程中的基底转移问题，从而降低单个设计的时间和成本。
激光切割、3D打印和微铣削等技术已被用于微流控器件的快速原型制作。激光切割是一种成熟的微流控制造方法，可使用二氧化碳激光器将图案直接蚀刻到塑料、粘合剂或纸质基底上。虽然这些方法的特征尺寸可以小至100 μm，但使用标准设置的激光切割会产生具有尖截面的通道，因而无法准确地转移到其他制作方法或采用具有多种深度的几何图形。此外，激光切割与某些热塑性塑料（例如聚碳酸酯、聚氯乙烯）不兼容，而且由于高强度激光造成的材料浸出，已被证明会抑制生物反应。
最近，3D打印微流控技术引起了人们的极大兴趣。立体光固化、多射流建模和熔融沉积建模等常见3D打印技术已被证明可分别获得100 μm、750 μm和350 μm的特征尺寸。在立体光固化技术中，只能使用光固化基底，这就限制了对更常见的大规模生产基底的可扩展性。目前的打印分辨率、表面特性和器件透明度阻碍了3D打印液滴微流控技术在生物高通量领域的应用。
据麦姆斯咨询介绍，美国波士顿大学的研究人员近期在Microsystems & Nanoengineering期刊上发表了一篇题为“Component library creation and pixel array generation with micromilled droplet microfluidics”的论文。该论文报道了一种液滴微流控组件库的构建和应用，具有快速原型设计及制造能力。通过结合微铣削和导电油墨电极集成，开发出了用于液滴生成、再注入、锚定、皮升注入、聚结和荧光激活液滴分选的液滴微流控组件。基于微铣削的液滴微流控技术为PDMS器件提供了一种替代方案，既可以直接替代PDMS器件，也可以作为快速迭代初始设计的辅助工具。该研究通过荧光细胞分选和像素阵列生成展示了组件库执行多步工作流的能力。
（a）液滴微流控组件的设计、构建和测试周期；（b）液滴生成、再注入、锚定、皮升注入、聚结和荧光激活液滴分选；（c）液滴微流控工作流示例。液滴在像素阵列中生成、再注入、传感、分选和锚定。在荧光细胞分选工作流中还可生成、再注入、皮升注入、传感和分选含有细胞的液滴。
液滴微流控组件的表征
这些液滴微流控组件具有生物相容性，并且被证明对荧光激活的生物表达水平液滴分选足够敏感。为了展示基于微铣削的液滴微流控技术的多功能性，研究人员将这些组件用于生成液滴像素阵列，以在多步工作流中进行图像生成。这种工作流需要高度的控制：如果锚阵列中的阻力过高，液滴就不会偏转而卡在锚内，或者分选电极无法偏转液滴；如果阻力过低，液滴就无法被限制在锚内，并发生非特异性分选。由于这种高灵敏度，较大的锚阵列受到固定液滴数量改变阵列内流速所引起的阻力变化的限制。
液滴生成率和再注入率受到器件粘合剂的限制。由于皮升注入压力的变化以及皮升注入器件输入和输出压力的整体波动，长期皮升注入具有挑战性。皮升注入的精度取决于稳定和周期性的液滴再注入，而这可能会受到入口和出口中气泡的影响。荧光传感和分选的液滴吞吐量受限于微控制器的数据收集和分析速度。由于细胞荧光输出的寿命有限，这一限制对于液滴和细胞分选非常重要。此外，如果在通道中加入皮升注入，有限的液滴吞吐量也会增加工作流的时间。总之，流速、激光强度以及传感和分选触发之间的延迟等方面的优化，会影响液滴再注入周期、液滴群之间的荧光传感阈值以及成功的分选和锚定。对于涉及荧光传感、液滴分选或液滴锚定的应用，不同参数之间的优化可能需要耗费大量的时间和资源。手动优化可能很耗时，可以利用自动化来改进器件测试。
尽管基于微铣削的液滴微流控技术在成本和时间上具有巨大优势，但其局限性使其无法完全取代PDMS器件用于原型制作。本研究中使用的数控铣削设备的最小通道尺寸为75 μm，无法产生小于此最小尺寸的液滴，影响了极高通量的性能，并限制了激发和发射源与流体通道的距离。虽然其它铣削设备已经证明可以在热塑性塑料和金属中蚀刻小至600 nm的特征尺寸，但这些铣削设备的基础设施成本很高，已经接近无尘室制造。
由于流体动力学可以扩展，因此微铣削设备可作为一种快速方法，用于制作全新设计的原型。此外，如果器件开发的目标是最终将系统移植到大规模制造的热塑性塑料中，聚碳酸酯则提供了一种在具有类似表面特性的刚性几何体中测试流体的方法。
液滴像素阵列生成工作流。（a）首先，选择一幅图像并将其“液滴化”为25个像素，然后将每个像素用液滴组合成最接近的颜色。最接近的颜色由红、绿、蓝的高低色阶来定义。接下来，生成一个液滴像素库，总共包含8种颜色。然后将这些液滴插入荧光分选装置，该装置会根据液滴图像的扫描确定液滴的排序。（b）使用此工作流，8种不同的颜色可生成、感测、分选并固定到像素阵列上。（c）使用双色输入，在液滴像素阵列上生成黑白字母数字符号库。
利用软件引导的液滴像素阵列生成大型马赛克图像
基于微铣削的液滴微流控技术对于计算机辅助设计（CAD）软件开发所需的大规模数据集生成尤为有用。最终，我们相信微流控CAD程序能够将高阶功能整合到液滴操作（生成、排序、合并、注入等）中，类似于CMOS数字电子组件的制造。虽然已经开发出多种微流控CAD工具，但大多数工具都缺乏全面的实验表征或用于性能预测的成熟数据集。之前的研究工作显示了利用基于微铣削的液滴微流控数据集的潜力：结合微铣削的大规模数据集和PDMS的小规模数据集，以流体不确定的方式实现了单乳和双乳液滴发生器的自动化设计。类似的工作流可以应用于这里开发的所有不同组件，以准确地将流动条件和设计几何图形精确映射到性能指标上，例如分选精度或皮升注入体积等。一旦实现，液滴操作就可以组成复杂工作流的自动微流控组件设计。然后，这些组件可以连接到独立的像素阵列，用于识别功能最强大的管线。根据阵列中的结果，同样的CAD软件可以自动修改设计，以解决新组件或不同参数的不足之处。
结论
综上，研究人员展示了一种液滴微流控组件库的开发、表征和应用，该组件库通过桌面微铣削设备和导电油墨电极以快速、廉价的方式制备。基于微铣削的液滴发生器的孔径为75 μm，能以4 Hz到368 Hz的速率产生直径为95 μm到176 μm的单分散液滴。液滴以100 Hz的频率喷射，平均液滴体积在-3%到+50%之间。研究人员使用三通道荧光传感技术测量了8个液滴组的混合群。液滴被感测、分类并锚定在100个独特的5 x 5网格中，生成像素阵列，进而验证了整个系统的功能。这些组件具有生物相容性，可与灵敏度足以测量生物表达水平的传感器配对使用，并已证明可在复杂的工作流中发挥作用，例如液滴像素阵列的图像生成和验证。
论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41378-024-00839-6
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