霉菌毒素是霉菌的次生代谢产物，通常会通过原材料污染葡萄酒，具有严重的生殖毒性、致畸性和致癌性，对葡萄酒行业造成严重影响。然而，传统的检测方法通常仅限于检测一种霉菌毒素，无法对实际样品中的多种霉菌毒素进行高通量、自动化和快速的定量分析。微流控芯片具有高通量、高度自动化、快速检测的特点，提高了用户的使用友好性。同时，化学发光成像系统具有高灵敏度和实时监测的优点，为实时检测多种霉菌毒素提供了有效的解决方案。
扬州大学尹彬沣副教授研究团队在高水平期刊Foods上提出了一种便携式自动化微流控平台（PAMP），实现了对葡萄酒中多种霉菌毒素的即时检测。该平台集成了化学发光（CL）成像系统和微流控芯片，在微流控芯片上以硅胶薄膜为底物培养霉菌毒素偶联物，并在硅胶薄膜上建立链霉亲和素-生物素（SA-B）体系和间接免疫分析法，以提高反应结果的敏感性，如图1。PAMP符合POCT的检测环境要求，特别适用于在没有先进实验室设施的情况下监测葡萄酒中的多种霉菌毒素。
图1 检测霉菌毒素的PAMP示意图。
研究团队采用间接竞争性免疫测定法对玉米赤霉烯酮（ZEA）、黄曲霉毒素B1（AFB1）、赭曲霉毒素A（OTA）三种霉菌毒素进行检测的同时还使用稳定的生物素标记检测抗体（IgG-B-SA-HRP）来提高免疫反应的特异性。该检测平台工作流程如图2所示。首先通过针头将葡萄酒注入储液槽中。然后，通过微流控芯片对ZEA、AFB1和OTA进行多重检测的方法将ZEA-OVA、AFB1-OVA和OTA-OVA的偶联物分别固定在三个平行带的反应层表面（图2B）。通过微阀将样品和捕获抗体注入微通道，以实现高效混合。免疫反应后，用PBST洗去与样品中靶标结合的捕获抗体。随后，将IgG-B-SA-HRP注射到微通道中，并与附着在硅胶膜上的捕获抗体结合，用PBST洗去多余的捕获抗体。最后，将化学发光底物引入微通道与HRP反应产生化学发光信号。
图2 （A）微流控芯片中的免疫测定步骤。（a）注入葡萄酒；（b，d）竞争性免疫测定；（c、e）清洁；（f）化学发光反应。（B）ZEA、AFB1和OTA的检测原理。
研究团队运用PAMP在1-32 ng/mL的线性范围内检测到ZEA（图3B），在0.2-6.4 ng/mL的线性范围内检测到AFB1(图3C)，在2-64 ng/mL范围内检测到OTA（图3D）。根据三倍信噪比公式，ZEA、AFB1和OTA的检出限分别为0.7619 ng/mL、0.1374 ng/mL和0.9183 ng/mL。检出限远小于线性范围表明该平台具有良好的灵敏度。同时，在测试的所有ZEA、AFB1和OTA组合中，仅结合特异性抗体和生物标志物会显著降低CL强度（图3E），表明该方法可以检测多种霉菌毒素。研究团队用同一批次的6个芯片检测相同的霉菌毒素。实验结果表明，ZEA、AFB1、OTA的CV均小于10%，证明该检测平台具有良好的重复性（图3G、H、I）。
图3 （A）用于检测的微流控芯片示意图。ZEA（B）、AFB1（C）和OTA（D）的线性范围。（E）ZEA、AFB1和OTA在不同组合下的CL强度。（F）ZEA、AFB1和OTA的特异性试验。ZEA（G）、AFB1（H）和OTA（I）的重复性。
与传统检测霉菌毒素的方法相比，本文提出的便携式自动化微流控平台简化了复杂的手动操作，缩短了检测时间，提高了检测灵敏度，在即时检测应用中具有很大的发展潜力。
论文链接：
https://doi.org/10.3390/foods13132066
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