据麦姆斯咨询介绍，美国莱斯大学（Rice University）Anna-Karin Gustavsson领导的研究小组开发了一种创新的成像平台，有望提高我们对纳米级细胞结构的认识。该平台被研究人员称为SoTILT3D（结合三维点扩展函数的单物镜倾斜光片），它在超分辨率显微镜方面取得了重大进展，能够对多种细胞结构进行快速、精确的3D成像，同时还能控制并灵活调整细胞外环境。这项研究成果已经以“Whole-cell multi-target single-molecule super-resolution imaging in 3D with microfluidics and a single-objective tilted light sheet”为题发表在Nature Communications期刊上。
莱斯大学研究小组成员，从左至右：Anna-Karin Gustavsson、Gabriella Gagliano和Nahima Saliba
在纳米尺度研究细胞可以帮助我们深入认识驱动细胞行为的复杂机制，帮助研究人员发现对健康和疾病至关重要的细节。这些细节可以揭示分子相互作用如何促进细胞功能，对于推进靶向治疗以及了解疾病发展机制至关重要。
虽然传统荧光显微镜可用于研究细胞结构，但它受到光衍射的限制，无法分辨几百纳米以下的特征。单分子超分辨率显微镜为纳米尺度的生物结构提供了突破性的洞察，但现有技术往往存在本底荧光高以及成像速度慢等问题，尤其是在处理厚样品或复杂细胞聚集体的情况下。此外，它们通常还缺乏对样品环境的精确、可调控制。
SoTILT3D平台有望直接解决这些挑战。SoTILT3D协同整合了倾斜光片、纳米打印微流控系统以及先进的计算工具，显著提高了系统的成像精度和速度。即使在传统的高难度样品中，SoTILT3D也能更清晰地观察到不同细胞结构在纳米尺度上的相互作用。
关键的创新
SoTILT3D平台采用单物镜倾斜光片选择性地照明样品薄片，通过减少焦外区域的背景荧光有效增强了对比度，特别是对于较厚的生物样品，例如哺乳动物细胞等。
SoTILT3D原型
莱斯大学化学助理教授、论文通讯作者Gustavsson说：“其光片利用显微镜中用于成像的同一物镜形成，它完全可操纵，通过噪声处理可消除光片显微镜中常见的阴影伪影，并能调整角度，使成像一直延伸到盖片。这使我们能够以更高的精度从上到下对整个样品进行成像。”
SoTILT3D方案展示及表征
该平台还集成了一个定制设计的微流控系统，内嵌可定制的金属化微镜，可实现对细胞外环境的精确控制，并能快速交换溶液，是无色偏多目标连续成像的理想选择，同时还能将光片反射到样品中。
该论文的共同第一作者Nahima Saliba和研究生Gabriella Gagliano表示：“其微流控芯片的设计和几何尺寸，以及带有微镜的纳米打印插件可以很容易地适应各种样品及长度，为不同的实验设置提供多功能性。”
此外，SoTILT3D还利用深度学习等计算工具分析更高浓度的荧光团，以提高成像速度，并利用算法进行实时漂移校正，从而实现长时间稳定的高精度成像。
Saliba说：“该平台的三维点扩展函数设计可实现单分子的3D成像，而深度学习可处理传统算法难以处理的密集发射器条件，从而显著提高采集速度。”
SoTILT3D系统中的微流控器件还支持自动Exchange-PAINT成像，在对纳米级目标进行深入成像时，可以依次对不同目标进行可视化，而不会出现多色方法中常见的色彩偏移。
突破性成果
SoTILT3D平台在成像精度和速度方面都有显著提高。与传统的落射照明方法相比，该平台的倾斜光片可将细胞成像的信噪比提高六倍，从而提高对比度并实现精确的纳米级定位。
Gagliano说：“这种程度的细节揭示了传统方法难以观察到的复杂3D细胞结构。”
在速度方面，SoTILT3D结合高发射器密度和深度学习分析将速度提高了十倍，使研究人员只需花很少的时间就能捕捉到整个细胞复杂结构的详细图像，如核纤层、线粒体和细胞膜蛋白等。此外，该平台还支持精确的全细胞3D多目标成像，捕捉整个细胞内多种蛋白质的分布，并测量它们之间的纳米级距离。现在，研究人员可以非常精确地可视化核纤层蛋白lamin B1和lamin A/C，以及LAP2等位置紧密的蛋白的空间排布，从而为蛋白组织及其在调控细胞功能方面的作用提供了新洞察。
利用SoTILT3D平台进行全细胞多目标3D高密度单分子超分辨率成像
生物学和医学领域应用广泛
SoTILT3D平台为各个领域的研究人员带来了新的可能性。它能够对包括干细胞聚集体在内的复杂样品进行成像，其应用范围超越了单个细胞。SoTILT3D微流控系统的生物兼容性，使其适用于活体细胞成像，使科学家可以实时研究细胞对不同刺激的反应，同时减少光损伤。其精确控制的溶液交换功能，也使SoTILT3D成为实时测试药物治疗如何影响细胞的理想工具。
SoTILT3D创建的样品图像
Gustavsson说：“我们开发SoTILT3D的目标是打造一种灵活的成像工具，克服传统超分辨率显微镜的局限性。我们希望这些进步能够促进生物学、生物物理学和生物医学领域的研究。因为，在这些领域，纳米尺度复杂的相互作用是了解细胞功能在健康和致病机制中的关键。”
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