宁波大学周前进副教授和陈炯研究员研究团队在高水平期刊Aquaculture上发表了最新研究成果，利用一种集成实时荧光重组酶聚合酶扩增（RPA）技术的离心式微流控芯片完成试剂和DNA混合液的自动化简单注射和同时检测，该芯片可同时实现四个样品6个目标基因的检测。
图1：(A)盘式微流控芯片的结构。1：反应室；2：球阀；3：排气口；4：样品室。(B) 分解视图。5：热封膜；6：芯片基板。
圆盘型多样品（多路样品）微流体芯片（MSMC），测量直径为81 mm，厚度为2.5 mm（图1A）。MSMC的材料是PMMA（聚甲基丙烯酸甲酯；有机玻璃）。由微注塑成型的芯片基板和热封膜组成，它们连接在一起以创建集成的密封室和通道（图1B）。MSMC被划分为四个独立的扇区，每个扇区包含两个相同的单元。每个单元配备有一个样品孔、一个排气口、四个球阀和四个反应室（图1A）。每个反应室的体积为5 μL。
图2：(C) 一个扇区中六套引物的详细结构
在这项研究中，扇区被用作分组单元，用于在芯片上分配引物。在每个扇区内，将用于检测五种虾病原体（VAHPND、WSSV、IHHNV、SHIV和EHP）的六组引物预先固定到不同的反应室中（图2C），从而形成“一个单元一个样品”的形式。这种设计使四个样品能够在单个芯片上同时分析。在使用热封膜进行芯片键合之前，先将每组引物预先固定在反应室中，包括内部阳性对照（PC）和阴性对照（NC）两者以确保试剂和芯片运行的可靠性（图2C）。
图3：(D) 芯片上RPA检测的操作流程
芯片上实时RPA测定需要使用RT-RPA Exo试剂盒。第一步使用实时RPA酶制备30 μL无引物反应混合物、17.6 μL缓冲液A、1.5 μL 280 mM乙酸镁、1.5 μL DNA模板混合物和2.8 μL探针混合物（VAHPND-PirA、VAHPND-PirB、WSSV、IHHNV、SHIV、EHP和PC的7种特异性探针）。第二步混合缓冲液和样品，再通过样品孔将反应混合物移液到一个单元中。第三步使用Parafilm密封样品孔和通风孔。最后将芯片安装在相匹配的装置上，并在39 ℃下进行反应20分钟（图3D）。结果显示为实时扩增图。
表1：芯片上RPA检测的临床灵敏度和特异性与结合DNA测序的PCR方法对比
这种芯片可以自动化简单注射试剂和DNA的混合物来同时检测四个样品。以最小的劳动力实现了优异的临床灵敏度和特异性用于检测田间虾病原体。总体而言，该芯片上RPA检测为现场实时检测以及虾病原体的常规监测提供了一个方便可靠的工具。
论文链接：
https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2023.740017
