集成微针和电化学传感器的可穿戴分析仪,用于葡萄糖和乳酸的体内监测

MEMS 2024-08-23 00:01
研究背景
使用基于微针(MN)的检测法连续监测组织液(ISF)中临床相关的生物标志物,有可能改变医疗保健。来自麦克马斯特大学(McMaster University)的研究人员提出了一种名为“Wearable Aptalyzer的集成系统,通过将用于ISF提取的生物相容性水凝胶MN(HMN)阵列与用于原位监测血液分析物的基于电化学适配体的生物传感器相结合而制造,可以用于ISF中葡萄糖和乳酸的实时和多路复用监测。使用1型糖尿病小鼠和大鼠模型的验证实验表明,从基于ISF的Wearable Aptalyzer收集的测量值与从血糖和乳酸金标准技术获得的测量值之间具有很强的相关性。Wearable Aptalyzer有效解决了酶检测方法以及实心MN生物传感器固有的局限性,以及对可靠和多路生物分析体内监测的需求。相关研究成果以“Wearable Aptalyzer Integrates Microneedle and Electrochemical Sensing for In Vivo Monitoring of Glucose and Lactate in Live Animals”为题发表在Advanced Materials期刊上
图1 用于体内分析的可Wearable Aptalyzer的制造

Wearable Aptalyzer的制造
集成的Wearable Aptalyzer将用于ISF提取的HMN贴片与用氧化还原适配体功能化的电极相结合,用于靶标分析。简而言之,透明质酸(HA)用甲基丙烯酸酸酐(MA)进行了过夜的化学修饰。然后对通过沉淀和透析纯化所得的MeHA进行冻干。随后,将HC-MeHA溶液浇铸到图案化模具中,以制造HMN贴片。经过过夜干燥过程后,将贴片脱模并在紫外线(UV)照射下交联40分钟。接下来,将100 μL LC-MeHA施加到功能化电极上,以形成覆盖工作电极、对电极和参比电极的薄粘合层。其中,LC-MeHA起到胶水的作用,将HMN贴片附着在固体电极上。随后,修剪交联的HMN贴片,将其置于LC-MeHA上,并风干30 min。最后,将集成器件在紫外线下进一步交联10分钟。利用LC-MeHA可以将电极牢固地连接到HMN贴片上,从而在随后的动物实验中增强了集成器件的稳健性。
该研究将集成的贴片/电极器件转换为可穿戴适配体。具体而言,研究人员将一种表征良好的适配体(乳酸或葡萄糖)通过金硫醇化学锚定在金工作电极上,并使用电化学阻抗谱(EIS)和循环伏安法(CV)验证其附着力。此外,用亚甲蓝标记适配体作为电化学信号转导的氧化还原报告基因。在靶标结合时,氧化还原适配体发生构象变化,使亚甲蓝靠近金表面,与没有靶标的情况相比,电子转移率增加。SWV用于测量Wearable Aptalyzer产生的信号。利用氧化还原适配体结合态和未结合态之间的电荷转移动力学差异来计算动力学差分测量(KDM)。该方法可有效减少传感器间的变异性,校正信号漂移,并提高信噪比。信号开启和信号关闭频率是使用Lovric形式确定的。葡萄糖和乳酸传感器分别在较高频率(葡萄糖为80 Hz,乳酸适配体为200 Hz)和较低频率(葡萄糖为5 Hz,乳酸适配体为15 Hz)下表现出信号开启和信号关闭响应。
Wearable Aptalyzer的物理表征
在制造HMN贴片之后,首先评估了它们的物理特性。为确保有效的皮肤渗透,HMN贴片必须具有锋利且完整的针头,这一点至关重要。使用扫描电子显微镜(SEM)评估HMN贴片的形态,显示完整而锋利的针尖。接下来,通过计算使用SEM成像的相应膨胀水凝胶的平均孔径来研究HC-MeHA和LC-MeHA水凝胶的孔隙率。HC-MeHA和LC-MeHA的孔隙率分别为37%和65%。HC-MeHA在HMN内形成致密的聚合物网络,从而在吸水后保持其结构。相比之下,LC-MeHA在HMN贴片和电极之间起到粘附层的作用,形成密度较低的聚合物网络。交联的程度主要取决于聚合物含量、紫外线固化的持续时间和交联剂的浓度。为了研究HMN贴片收集足够ISF所需的持续时间,使用猪皮评估了HMN的肿胀能力。使用HC-MeHA制备HMN贴片,在其背面增加一层LC-MeHA(HC+LC-MeHA HMN),并在一块猪皮肤上应用不同持续时间,并测量其相应的肿胀率。我们观察到HC+LC-MeHA HMN贴片在猪皮肤应用后6 min内达到119.45%的最大肿胀,表明HMN有助于在真实皮肤环境下快速有效地收集ISF样本。
图2 HMN贴片和集成的Wearable Aptalyzer的物理表征

通过压缩测试评估了HMN贴片的机械强度,评估了它们穿透皮肤的能力。通过对HC+LC-MeHA HMN贴片进行检测,探讨添加LC-MeHA对HMN贴片力学性能的影响。测量并绘制了施加压缩力后针尖的位移。该数据表明,HC-MeHA HMN和HC+LC-MeHA HMN每根针头都可以承受超过0.3 ~ 0.4 N的力,这对于穿透人体皮肤是必要的,而不会发生明显的针头断裂。重要的是,包含LC-MeHA层不会影响HMN贴片的机械强度。
在表征了HMN贴片的物理性质后,将HMN贴片与使用LC-MeHA作为粘附层的氧化还原适配体功能化的电极集成在一起。为了评估HMN贴片与电极的附着,进行了拉动实验。如图2f所示,模拟HMN贴片的HC-MeHA薄膜通过一层LC-MeHA附着在功能化电极上。然后连接一条非弹性胶带并施加侧向力,将薄膜从电极上拉开,并在实际应用中的身体运动过程中刺激施加在HMN贴片上的力。
Wearable Aptalyzer传感与优化
在验证Wearable Aptalyzer的实际应用性能之前,使用CV和EIS在开路电位下对器件制造进行电化学表征。用葡萄糖和乳酸适配体探针进行生物功能化后,电极的电荷转移电阻分别增加了12366%和3073%。此外,在添加巯基己醇(MCH)作为葡萄糖和乳酸传感器的表面阻断剂后,抵抗力进一步增加了22%和70%。最后,在连接HMN后,电荷转移电阻如预期般增加了23%和25%。在Wearable Aptalyzer的每个制造步骤之后,还记录了CV测量值。与前一步相比,每一步制造后都观察到电化学电流减少。这是由于在制造过程中添加的每一层都施加了空间位阻,从而减少了电解质对电极表面的接触。观察到的电化学电流趋势与EIS计算的电荷转移电阻结果一致,并证实了每个功能层都成功地添加到器件中,进一步验证了Wearable Aptalyzer的成功制造。
接下来,使用加标不同浓度的目标分析物的人工ISF(aISF)对葡萄糖和乳酸Aptalyzer传感器进行体外评估。验证实验以迭代方式进行,从空白aISF样品开始,然后增加浓度(向上校准),或者从aISF中目标分析物的最高浓度开始,然后稀释(向下校准)。葡萄糖Aptalyzer暴露于浓度范围为0 ~ 50 mM,涵盖正常生理范围,以及超过低血糖和高血糖水平。选择0 ~ 20mM的乳酸范围以包括生理范围以及高乳酸血症。孵育20分钟后,测量电化学信号。在向上校准期间,Aptalyzer传感器会产生一个电化学信号,该信号随着目标分析物浓度的增加而单调增加,与适配体传感器的操作机制保持一致:由于亚甲蓝与电极的相互作用更频繁,目标浓度的增加导致更大的电化学电流。然后计算所得的KDM,以获得葡萄糖和乳酸 Aptalyzer传感器的校准曲线。与葡萄糖校准曲线的对数线性拟合产生2.4 mM的检测限,用于检测覆盖低血糖范围的葡萄糖。此外,通过将对数线性线拟合到乳酸校准曲线,可实现1.04 mM的检测限。在向下校准过程中观察到不同的行为,导致葡萄糖和乳酸的检测限分别为7.44和4.43 mM。
图3 Wearable Aptalyzer的离体验证

为了进一步研究所开发平台的完整性,葡萄糖Aptalyzer传感器通过引入一组在ISF中发现的常见干扰剂来挑战,包括乳酸、抗坏血酸、甘氨酸、L-丙氨酸、氯化镁、羟基丁酸酯、蔗糖、尿酸、牛血清白蛋白(BSA)和半乳糖,所有这些都在aISF中加标。除氯化镁外,aISF中所有化合物的浓度均为10 mM,氯化镁为5 mM(葡萄糖的浓度在生理范围内,但其他干扰物的浓度明显高于正常水平)。在所有测试的干扰物(包括糖和氨基酸)中,没有一种表现出对检测葡萄糖的干扰,显示出葡萄糖Aptalyzer传感器的优异特异性。同样,通过引入在ISF中发现的相同浓度的干扰化合物来检查乳酸Aptalyzer的选择性。计算出的信号增益清楚地表明,尽管非目标分子的浓度非常高,但乳酸Aptalyzer传感器对乳酸表现出优异的选择性。
使用小鼠模型对Wearable Aptalyzer进行体内验证
在验证了Wearable Aptalyzer离体的性能后,研究人员使用动物模型评估了集成器件的性能。在体内评估之前,建立了基于单频电化学阻抗测量的质量控制程序,以识别有故障的传感器。根据此程序,传感器演示|ΔZ/Z| > 500个在插入皮肤后被认为是有缺陷的,被排除在外。ΔZ/Z表示与功能化传感器相比,将HMN连接到Wearable Aptalyzer后观察到的电化学阻抗变化。此外,葡萄糖装置在80 Hz时的电流为-30 nA,乳酸装置在200 Hz时的电流为-100 nA,被确定为体内测试的截止点。还确定了噪声值为0.01的均方根(RMS)和信号开启条件下的信噪比为3作为体内实验的临界值。传感器故障可能是由于HMN贴片与电极的连接不完整或HMN贴片与皮肤的插入不完美造成的。采用Wearable Aptalyzer传感器,通过将集成器件应用于健康的野生型小鼠的背部皮肤,对健康的野生型小鼠进行连续的葡萄糖和L-乳酸测量。首先通过应用Wearable Aptalyzer 5分钟并在移除器件后收集皮肤样本来评估HMN贴片的渗透。同时,从尾部收集的小鼠血液样本用于使用手持式血糖仪测量血糖,如所述。通过Wearable Aptalyzer测量的血糖水平和葡萄糖KDM值在测试动物上遵循类似的变化趋势。这证实了Wearable Aptalyzer在检测波动的葡萄糖浓度方面的可靠性。
图4 小鼠模型中的体内葡萄糖和乳酸检测

用于多路复用测量的Wearable Aptalyzer的体内验证
为了评估我们的检测在各种动物模型中的潜在适用性,使用糖尿病大鼠模型进一步表征和测试了Wearable Aptalyzer。首先,研究了该装置对大鼠皮肤渗透的有效性以及应用HMN后皮肤的恢复效果。图5a显示了Wearable Aptalyzer在皮肤穿透前后,突出了皮肤穿透时肿胀和完整针头的存在。此外,HMN和电极之间的连接保持牢固就位。随后,研究人员监测了HMN穿透后针头在大鼠皮肤上的痕迹(图5b)。在取下HMN贴片后,立即观察到针头的明显印记,提供了有效皮肤渗透的明确证据。然而,针印在20分钟后消失,表明皮肤恢复。皮肤的H&E染色还显示大鼠皮肤内有一个深度为92.5 μm的针腔(图5c)。这些结果表明,Wearable Aptalyzer能够有效地穿透大鼠皮肤,并且在移除后,皮肤表现出快速恢复。
图5 使用Wearable Aptalyzer进行体内表征和多路复用监测

通过使用Wearable Aptalyzer器件,对糖尿病大鼠的葡萄糖和乳酸进行了同步、多路复用测量。具体来说,连续监测乳酸和葡萄糖可以准确评估运动的代谢副产物,该副产物与糖尿病患者的运动强度相关,并有助于准确预测血糖反应和必要的胰岛素剂量。糖尿病大鼠在实验前禁食4小时,然后给予人重组胰岛素以降低其血糖水平。将两个乳酸和两个葡萄糖Wearable Aptalyzer传感器应用于大鼠的剃光背部,并连续监测动物的葡萄糖和乳酸水平。数据是在五个不同的时间点收集的。同时,从葡萄糖和乳酸器件获得的数据分别使用手持式血糖仪和比色L-乳酸试剂盒进行交叉验证。葡萄糖Wearable Aptalyzer显示胰岛素注射后KDM降低,而乳酸KDM随着时间的推移保持一致,证实了与基于血液的测量相似的变化趋势。
总结
综上所述,研究人员报告了一种基于适配体的电化学传感器,可以与HMN集成,用于ISF中生物标志物的实时和体内分析。该器件被称为Wearable Aptalyzer,将使用超灵敏电化学读数的原位生物标志物测量与强大的HMN机械强度相结合,可实现有效的皮肤渗透和ISF采样。Wearable Aptalyzer在检测真实皮肤环境中的临床相关葡萄糖和乳酸浓度方面表现出高灵敏度和特异性。使用小鼠和大鼠模型研究了Wearable Aptalyzer的性能。重要的是,Wearable Aptalyzer显示出稳定的电化学信号,能够连续监测乳酸,在清醒的糖尿病大鼠中,乳酸与血乳酸相关至少3天。从健康小鼠和糖尿病大鼠获得的体内结果表明,Wearable Aptalyzer在监测两种不同动物模型的葡萄糖和乳酸变化趋势波动方面具有功效。特别是,利用Wearable Aptalyzer同时监测葡萄糖和乳酸,凸显了其为糖尿病管理定制个性化治疗方法的潜力。值得注意的是,Wearable Aptalyzer作为一个通用的传感平台,能够使用不同的适配体追踪各种临床上重要的生物标志物,而这些都是酶促无法实现的。这证明了将Wearable Aptalyzer应用于广泛的连续监测技术的潜力。

论文链接:

https://doi.org/10.1002/adma.202313743


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