生物荧光检测技术原理
一 、荧光产生机理
荧光是一种光致发光现象。荧光指的是某些化学物质在吸收外界光后自身冷发光的现象，微观上即基态电子吸收光子跃迀为激发态，而后返回基态释放光子的过程。
图1 光能的吸收，转移和发射示意图
电子在同类分子或其它分子中撞击，消耗了相当的能量,从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级,能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级,同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光,就是荧光，如图1。被化合物吸收的光称为激发光,产生的荧光称为发射光。
荧光的波长总要比分子吸收的紫外光波长长，通常在可见光范围内。激发光峰值位置与荧光峰值位置的波长差，称为斯托克斯（Stokes）位移。荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光。
图2 荧光衰减曲线
发光照射荧光物质产生的荧光不会随着激发光停止而立即消失，而是逐渐衰减，即荧光光子具有一定寿命，如图2所示。荧光寿命ｔ定义为荧光强度衰减为最大强度的1/e时所用的时间。
二 生物诱导荧光检测原理
检测时，使用特定波长的激发光照射样品，诱导产生的荧光物质会吸收激发光的能量并跃迁至激发态，然后从激发态回到基态的过程中释放出波长较长的荧光。通过检测荧光的强度、波长、偏振态、寿命等参数，可以获取有关生物分子的存在、浓度、活性以及生物过程的信息。
荧光检测技术是传感领域的主要检测方法，具有快速、简单、方便、高灵敏度等特点。它通常需要用荧光染料标记目标分子，通过检测荧光特性对标记物进行定性或定量分析。基于有机染料的荧光检测方法具有简单多样、实时无损的特点，已有许多有机染料、荧光蛋白和发光金属络合物被用于荧光检测，促进了光学传感、光学成像等领域的进步。
目前的荧光检测大多是基于荧光纳米材料的光电特性，与其他技术相结合进行综合测量的。广泛应用的荧光纳米材料包括量子点（QDs）、上转换纳米粒子（UCNPs）、金属纳米团簇、聚合物点（Pdots）、荧光硅纳米材料以及荧光碳纳米材料 。
荧光检测系统的基本组成如下
激发光源：使用紫外光或可见光作为激发光源，波长范围通常在300nm至500nm之间，具体取决于目标荧光分子的吸收光谱。
荧光发射：当生物样品中的荧光分子被激发光源照射时，它们会吸收光子的能量，从基态跃迁到激发态。然后，这些分子以非辐射途径（如振动）释放部分能量，回到较低的能量状态，最终返回基态时，会发射出较长波长的光子，即荧光。
荧光收集与检测：通过光学系统（如显微镜、光纤、透镜等）收集荧光信号，并使用滤光器去除激发光和其他非荧光背景，只让特定波长范围的荧光通过。最后，荧光信号由光电探测器（如光电倍增管、CCD相机）接收并转换为电信号。
数据处理与分析：收集到的电信号会被数字化并存储，然后通过计算机软件进行分析，提取荧光强度、分布模式等信息，用于生物样品的定性和定量分析。
生物诱导荧光检测技术在医学领域有广泛的应用，包括但以下几个方面：
肿瘤诊断：某些肿瘤细胞会特异性地摄取或产生特定的荧光物质。通过荧光检测，可以辅助识别肿瘤的位置、大小和边界，提高手术的准确性。
病原体检测：例如检测细菌、病毒等病原体，通过特定的生物诱导反应产生荧光，实现快速准确的诊断。
细胞凋亡检测：监测细胞在凋亡过程中的生物化学变化，诱导产生荧光，从而评估细胞的健康状态和疾病进程。
免疫分析：检测体内特定抗体或抗原的水平，用于诊断免疫相关疾病。
药物代谢研究：追踪药物在体内的分布和代谢过程，了解药物的作用机制和疗效。
心血管疾病诊断：检测血管内皮细胞的功能和损伤情况，有助于早期诊断心血管疾病。
神经系统疾病研究：如检测神经细胞内特定生物分子的变化，辅助诊断神经系统疾病。
三、生物发光机理
生物发光(bioluminescence)是指生物体发光或生物体提取物在实验室中发光的现象。它是在有机活体组织中，底物荧光素“luciferin”(天然色素)与荧光素酶“luciferase”(生物酶)通过生物化学反应将化学能转化为光能的现象。是一种特殊的化学发光，不依赖于有机体对光的吸收。
生物发光反应在某种意义上说就是一个化学发光反应，它的一般机制是通过细胞合成的化学物质(荧光素)，在一种特殊酶(荧光酶)的作用下，与分子氧反应产生光，有时候需要辅助因子例如钙离子或三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP)作为媒介控制反应，把化学能转化为光能。
图3 三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP) 结构图
三磷酸腺苷和荧光素（luciferin）产生的腺苷酰被 Mg2+和荧光素酶（luciferase）活化，荧光素经过活化后与荧光素酶结合成生成一种中间复合物（荧光素腺苷酸）和焦磷酸（PPi）；荧光素腺苷酸与氧气结合，产生了位于560nm 处的荧光和氧化荧光素，放出 CO2。公式如下
而生成荧光的发光强度（I）和 ATP 的浓度（CATP）存在一定的函数关系，其函数关系如下
（1）
式中 Imax为最大发光强度，Km=1×10-4 由式（1）可以通过发光体系的 I 值定量 ATP 的浓度。当 Km大于 CATP，I 值与样品中的 CATP呈正比例关系。又因为微生物细胞中的 ATP 浓度是一定的，通过样品中 ATP 浓度可反推出微生物的数量。通过测量的发光强度的大小就可以反向推导出被测样品中 ATP 的含量。
四 生物自发光检测原理
生物发光检测的基本原理是利用某些生物体内存在的能催化特定化学反应产生可见光的酶 - 荧光素酶，以及相应的底物 - 荧光素。当发光酶催化萤光素的氧化时，会释放出光子，产生可见光。这一过程在多种生物体中自然发生，包括萤火虫、海洋生物、某些真菌和细菌。
在实验室和研究环境中，生物发光检测技术主要通过以下步骤实现：
1. 基因工程
通过基因工程技术将编码发光酶的基因插入到感兴趣的细胞或生物体中。最常用的发光酶是萤火虫萤光素酶（Firefly Luciferase），但也有其他种类的发光酶，如海肾萤光素酶（Renilla Luciferase）和细菌发光酶系统。
2. 底物添加
为了激活发光反应，需要向实验系统中加入底物——萤光素。萤火虫萤光素酶的底物是D-萤光素（D-Luciferin），而海肾萤光素酶则使用另一种类型的萤光素。
3. 光学检测
发光反应产生的光信号通过高灵敏度的检测设备（如光子计数器、CCD相机或专用的生物发光成像系统）捕捉。这些设备能够检测到极微弱的光信号，甚至是在活体动物体内发生的生物发光。
4. 数据分析
检测到的光信号强度与生物体或细胞内的特定生物过程相关联。例如，如果发光酶的基因与特定的启动子相连，那么光信号的强度就可以反映该启动子控制的基因表达水平。此外，光信号还可以反映细胞活力、代谢活性或特定分子的浓度。
生物发光检测的优点
高灵敏度：即使是非常微弱的光信号也能被检测到。
非侵入性：可以在活体生物或细胞中实时监测生物过程，无需破坏样本。
高特异性：通过特定的启动子或细胞特异性表达系统，可以实现对特定细胞类型或生物过程的精确监测。
生物发光检测在分子生物学、遗传学、药理学、环境科学等领域有着广泛的应用，特别是在研究基因表达、蛋白质功能、药物筛选和环境污染物检测等方面。
ATP生物发光检测（ATP Bioluminescence Detection）是一种基于生物发光原理的检测技术，用于快速、灵敏地测定样本中的三磷酸腺苷（ATP）含量。ATP是所有活细胞中的能量货币，因此其存在和浓度可以指示样本中微生物或其他活细胞的污染程度。以下是ATP生物发光检测的基本原理：
1 ATP的释放：
当细胞死亡或破裂时，细胞内的ATP会被释放到细胞外环境中。在ATP检测过程中，会使用一种裂解液（lysis solution）来裂解样本中的任何细胞，确保所有细胞内的ATP都被释放出来。
2 发光反应：
ATP生物发光检测利用了萤火虫的发光机制，即“荧光素酶-荧光素系统”。荧光素酶（luciferase）是一种能够催化荧光素（luciferin）和ATP反应的酶，产生光子，即生物发光（bioluminescence）。反应中，荧光素酶催化荧光素和ATP在氧气和镁离子的存在下形成氧化荧光素，同时释放出光子。
3 光信号的检测：
使用ATP荧光检测仪来捕捉并测量反应中产生的光子数。光子数量与样本中ATP的浓度成正比，因此可以通过测量光信号的强度来定量样本中的ATP含量。
4 结果分析：
根据光信号的强度，通过预设的标准曲线或数学模型，可以计算出样本中ATP的浓度。由于ATP含量与活细胞数量密切相关，因此这个数值可以用来评估样本的卫生状况或微生物污染程度。
