多光子成像在生物医学特别是脑科学研究中应用广泛，为深层生物组织结构及动力学研究提供了非侵入性和非破坏性的成像手段。
生物组织的吸收和强散射特性限制了成像深度。近年来，得益于原理及技术上的进步，多光子成像在活体生物中的成像深度显著提高。其中，1700 nm波段激发的多光子成像显著降低组织吸收及散射，与其他激发波段相比获得了目前最大的成像深度。
深圳大学王科教授团队在《激光与光电子学进展》发表的特邀封面文章“1700 nm波段超快光纤光源开发及其在多光子成像中的应用”，介绍了多光子显微成像原理，并利用孤子自频移效应构建1700 nm波段飞秒脉冲光源。在此基础上，介绍了1700 nm波段多光子成像在活体小鼠脑部、皮肤结构，以及血流动力学成像中的应用。最后总结分析1700 nm波段激发多光子成像目前遇到的挑战和未来发展方向。
基本原理
多光子荧光成像原理
多光子荧光是多个激发光子与物质相互作用，只在焦点处产生显著荧光信号，具有本征的三维成像能力、亚微米量级成像分辨率和毫米量级成像深度。在多光子显微成像中，焦点处多光子信号与样品表面的功率、光子数、散射长度和吸收长度有关。
图1 单光子激发和双光子激发
如图1所示，单光子荧光在整个激发光通路上都会产生，而多光子荧光是多个激发光子与物质相互作用，有效减少组织散射的影响，从而减小激发光在传输过程中的损耗，具有更强穿透性，能够实现深层生物组织成像。多光子成像包括双光子、三光子及更高阶次显微成像，双光子显微成像包括双光子荧光成像和二次谐波成像，三光子显微成像包括三光子荧光成像和三次谐波成像。
光纤的孤子自频移效应
20世纪80年代，Mitschke和Mollenauer在反常色散的光纤中发现了孤子自频移现象。他们在实验上验证了亚皮秒脉冲在光纤中形成孤子后，通过脉冲内受激拉曼散射将能量连续地从高频段传输到低频段，从而实现波长红移。孤子能量正比于光纤有效模场面积，提高孤子能量的一个简单有效的方法就是增加光纤的有效模场面积。如图2所示，可以看到不同种类光纤有效模场面积以及其对应的孤子脉冲能量概括。
图2 不同光纤孤子能量和模场面积
搭建1700 nm飞秒脉冲光源
飞秒脉冲光源是多光子显微成像的基础。因此，搭建1700 nm波段飞秒脉冲光源是多光子深层脑成像的必要条件。适合1700 nm波段多光子深层脑成像的飞秒脉冲光源最早通过棒状光纤中的孤子自频移实现，此后科研人员利用棒状光纤、大模场光纤、空芯光纤搭建了不同的1700 nm波段飞秒脉冲光纤光源——线偏振孤子光源、圆偏振孤子光源、椭圆偏振孤子光源、偏振孤子合成光源、偏振复用孤子光源、空芯光纤的孤子光源以及自相位调制飞秒脉冲光源，如图3所示。
图3 1700 nm波段飞秒脉冲光源搭建及多光子成像
应用研究
活体小鼠深层脑血管成像。1700 nm波段激发可用于三光子和双光子成像，采用更亮的标记物可提升成像深度，新材料如聚集诱导发光材料等在该波段多光子深层生物组织成像中有重要应用。
活体小鼠深层血流速度测量。多光子显微成像技术可用于血流动力学测量，采用荧光标记物或三次谐波成像可测量血流速度，目前最深的血流速度测量深度为1600 μm。
活体小鼠深层脑细胞成像。利用1700 nm波段三光子荧光成像技术可实现转基因小鼠海马体神经细胞成像和普通小鼠深层脑部星形胶质细胞、微胶质细胞成像，成像深度分别为1076 μm、910 μm和1124 μm。
活体小鼠头骨及穿透头骨成像。1700 nm波段三光子成像技术可用于穿透头骨成像，实现活体小鼠头骨中骨细胞以及所处环境的“三明治”结构成像、穿透头骨脑表面下血管成像和完整头骨表面下深层血管成像。
活体小鼠深层皮肤成像。1700 nm波段激发三光子显微成像可实现活体小鼠完整的皮肤成像，包括角质层、皮脂腺、脂肪细胞、胶原蛋白、淋巴管、髓鞘和弹性纤维等，还可用于皮肤疾病诊断、皮肤衰老检测等。
总结展望
尽管1700 nm波段激发三光子荧光成像在活体小鼠脑血管结构和血流动力学测量方面取得了重要进展，但在脑细胞成像和脑细胞动力学方面的应用仍受限。
未来，结合自适应光学技术和开发近红外波段的高亮度荧光探针有望提高成像深度和分辨率；腺相关病毒的发展也将为深层脑部结构成像提供可视化技术支持；此外，2200 nm波段也有望应用于深层生物组织成像。
多光子成像技术的不断发展为我们深入了解生物组织的结构和功能提供了强有力的工具，期待未来能有更多的突破和应用，为生命科学研究带来更多的惊喜。
