纳米孔检测在过去20年里成为了非标记分子检测的标志性技术。但传统的电驱动手段难以控制分子的行为，导致准确检测分子结构特征依旧十分困难。使用蛋白质马达可以实现分子易位速度的减缓，但在固态纳米孔中实现稳定的蛋白质马达易位速度仍然具有挑战性，这阻碍了对电导信号不均匀性的改善。因此，限制纳米孔内分子动力学的随机性，控制分子易位速度，提高分子构象检测的高保真度和灵敏性依旧具有重要价值。近期，香港中文大学生物医学工程系何浩培教授-袁武教授团队在Nature Communications期刊上在线发表了题为“In-tube micro-pyramidal silicon nanopore for inertial-kinetic sensing of single molecules”的工作。该研究将惯性动力调节的分子易位方法集成在金字塔形硅纳米孔中。通过调节金字塔形离心力场分布并同时保持纳米孔内电泳和电渗效应的平衡状态，调控了蛋白质在纳米孔内的易位来延长其阻滞时间，获得了具有高构象灵敏度的稳定信号。该研究还探讨了信号的阻断时间与分子质量和形状之间的关系，以验证该技术在表征分子构象方面的功能。在本工作中，研究人员首先将光伏蚀刻停止辅助各向异性化学蚀刻技术引入到了纳米孔制备中，实现了在微米厚的单晶晶片上对硅纳米孔尺寸的控制（图1）。该技术首先追踪刻蚀过程中硅的透射光谱特性，精确调控了硅的剩余厚度。在之后的光抑制效应辅助的蚀刻过程中，剩余厚度决定了硅/蚀刻剂界面上中心暗区（快速蚀刻区域）的大小，这最终决定了硅的孔径。结果表明，通过对剩余厚度和过蚀刻时间组合的调控，可以实现孔径偏差约为1.1 nm的精密纳米孔制备。该金字塔状硅纳米孔良好的机械强度可以承受超高速离心中的惯性力，而在纳米孔设计中加入金字塔形状有助于有效引导目标分子进入纳米孔。
图1 金字塔状硅纳米孔的制造过程、相关控制信号和最终示意图
为了实现分子在纳米孔内的可控易位，该金字塔状硅纳米孔被集成在实验室级离心机中，实现惯性动力学调节的分子易位。分子的传统电驱动易位受纳米孔中的电泳力和电渗力控制，但通过调节分析物介质的pH值并测量每个待测分子的特征pH值可以实现这两种电驱动力的平衡。当金字塔状硅纳米孔被离心时，其金字塔设计可提供有利的金字塔状离心力场，该力场可有效捕获分子并引导分子通过纳米孔，从而克服布朗运动和分子-孔相互作用引起的势垒。此外，金字塔结构可提供更长的传感长度，支持分子在传感区域更长的停留时间。在惯性易位事件中，停留时间几乎与偏置电压无关，而电流阻断幅度与旋转速度几乎无关。这提供了一种新方法来调整和定制所需的电流阻断信号，以实现传感分子的最佳构象灵敏度。与电驱动易位事件方式相比，惯性易位事件将分子停留时间提高了一个数量级到数十毫秒，并且将的停留时间的变异系数降低了2倍以上，显示了显著增强的易位稳定性。
图2 通过无线传输接收管内分子惯性易位时产生的电流阻断信号
从理论上讲，分子的惯性易位时间与分子的质量和形状高度相关。为了验证该管内装置表征分子质量和形状的能力，六不同质量和形状的代表性分子被该装置测试（图3）。研究人员通过扫描转速，施加不同的离心力进行了分子易位信号的获取。对纳米孔中分子运动的分析表明，停留时间的平均值和标准偏差与惯性惯性易位中的旋转速度成反比。惯性易位下的分子停留时间既可以线性表征分子的形状因子，也可以指数表征分子的质量。
图3 各种惯性驱动的分子传感示例
此外，该管内装置也被用于监测分子反应和聚集过程引起的构象变化（图4）。研究人员通过比较抗体分子和抗体-抗原复合物的特征电流阻断信号，发现复合物的阻断信号具有比抗体更大的幅值。基于这一特征可以有效区分这两种分子。因此，通过实时监控抗体-抗原复合物的电流阻断信号中该幅度特征的变化，验证了复合物在特定pH值盐溶液中的逐渐解离过程。研究人员也通过离心分离方案纯化的纳米金颗粒聚集体的阻断信号检测到了聚集体分子数与电流阻断信号峰值数的对应关系。因此，通过实时监控纳米金颗粒在超声后的阻断信号变化，检测到了金颗粒不同聚集体的相对数量随时间的变化。
图4 对抗体-抗原复合物和纳米金颗粒聚集体的构象变化的检测
研究人员最后介绍道，该管内装置用于分子构象区分的可行性已被证明。该装置有望集成智能数据驱动的闭环策略，进一步提高管内装置的可控性和传感能力。此外，阵列化并行制造工艺的开发与自动制备平台的建设也将极大提高装置的通量。这些新策略的引入将进一步提高管内纳米孔系统对分子的自动和定量识别的效率，早日实现商业化的转化和使用。香港中文大学生物医学工程学系的何浩培教授和袁武教授为该论文的共同通讯作者，博士研究生杨剑鑫为本论文的第一作者。论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-48630-5
延伸阅读：
《即时诊断应用的生物传感器技术及市场-2022版》
