拉曼光谱学（Raman spectroscopy）提供了一种微尺度下对化学成分的无损、无标记定量研究手段。现有的拉曼光谱仪微型化策略主要存在以下问题：光谱分辨率及光谱范围不足、高水平传感器暗噪声导致的信噪比（SNR）受限、传感器像素间的量子效率（QE）变化较大、共焦性或深度分层差、激光波长和激光器光功率不稳定、激光光学反馈灵敏度高以及功耗高。
据麦姆斯咨询报道，近日，丹麦技术大学（Technical University of Denmark）的科研团队提出了一种厘米级微型拉曼光谱仪，采用了经济型非稳定激光二极管、密集光学元件和非制冷小型传感器。其性能可与昂贵、体积庞大的科研级拉曼系统相媲美。该微型拉曼光谱仪具有出色的灵敏度、低功耗、完美的波数以及强度校准，并在400 ~ 4000 cm⁻¹范围内利用内置参考基准实现了7 cm⁻¹的分辨率。该微型拉曼光谱仪的高性能和通用性在应用实例中得到了证明，应用实例包括饮品中甲醇的定量测定、人体皮肤的活体拉曼测量、发酵监测、亚微米分辨率的化学拉曼映射、抗癌药物甲氨蝶呤（MTX）的定量表面增强拉曼光谱（SERS）映射以及体外细菌鉴定等。可以预见，这种微型化策略有望使超紧凑型拉曼光谱仪集成到智能手机和医疗设备中，从而推动拉曼技术的普及。相关研究成果以“Optics miniaturization strategy for demanding Raman spectroscopy applications”为主题发表在Nature Communications期刊上。该论文的第一作者和通讯作者均为Oleksii Ilchenko。
拉曼光谱仪的微型化
拉曼系统的微型化主要包括：（1）光谱仪的微型化；（2）拉曼光束传输路径的微型化；（3）激光光束传输路径的微型化；（4）分束装置的微型化；（5）采样光学元件的微型化。因此，除光谱仪本身外，微型化还会影响激光器的选择。这项研究从激光器相关问题开始阐述其微型拉曼光谱仪。
该研究所研制的微型拉曼光谱仪的光学方案如图1a所示。近红外（NIR）增强成像CMOS传感器在800 ~ 960 nm波段同时采集了“指纹”范围（400 ~ 2700 cm⁻¹）的两个拉曼光谱（即主通道和参考通道），如图1c所示。
图1 微型化拉曼系统的光学布局及工作原理
拉曼光谱仪的灵敏度很大程度上取决于探测器的暗噪声。为了在不显著降低灵敏度的前提下实现微型化，研究人员采用了具有4 µm小像素尺寸的CMOS传感器，并使用高数值孔径（NA）成像镜头（图1a中的L6）将拉曼光谱信号压缩到传感器上的单行中（如图2a）。信号压缩带来的好处主要有：（1）最大限度提高每个像素的信噪比；（2）避免对具有非必要额外暗噪声的额外行进行平均。实验显示，SERS信号总强度等量分布在CMOS传感器的20行中（如图2b）。该微型拉曼光谱仪采用非波长稳定激光器，这使其能够补偿另一个灵敏度限制因素，即光谱传感器像素间的QE变化（如图2e）。
图2 微型化拉曼系统的灵敏度和量化性能论证
这项研究采用了一种离轴激光光束传输方法，该方法避免了激光反向反射进入激光孔径，同时提高了微型化能力（如图2h）。除了激光光学隔离外，离轴激光光束传输还支持空间偏移拉曼光谱（SORS）条件，使其避免样品内部离焦层产生不必要的荧光。
微型拉曼光谱仪的应用实例
随后，研究人员分别在五个应用实例中证明了该微型拉曼光谱仪的高性能和通用性。
应用实例一：伏特加中有毒甲醇的定量测定。为了证明该微型拉曼光谱仪的灵敏度和定量性能，研究人员对含有不同浓度甲醇的伏特加样品进行了测量。甲醇定量的偏最小二乘法（PLS）校准结果如图2l至图2p所示，检测限（LoD）为0.07%，定量限（LoQ）为0.25%。
应用实例二：发酵过程中营养物质和代谢物的定量测定。研究人员使用微型拉曼光谱仪对大肠杆菌培养过程中产生的pHCA进行离线定量测定，直接测量了细菌上清液样品的拉曼信号（如图3g）。结果表明，该微型拉曼光谱仪具有较高的灵敏度，pHCA的检测限约为0.01 g/L，葡萄糖的检测限约为1 g/L。
图3 用于发酵监测和活体皮肤测量的微型拉曼光谱仪
应用实例三：活体皮肤测量。活体皮肤测量通常需要复杂的拉曼仪器，这是由于皮肤的拉曼横截面较小，特别是在深度超过100 μm时，需要深度制冷传感器。图3j和图3k展示了紧凑型皮肤探针。该探针可以优化不同深度的皮肤测量（0 ~ 150 µm）。当微型拉曼光谱仪配备这种探针时，能够采集10 ~ 20 µm深度的皮肤拉曼光谱，信噪比优于500:1（1 s曝光时间，重复5次）。图3n至3s显示了两种激光（785 nm和675nm）在不同皮肤区域（手指、手和脸颊）获得的拉曼光谱。
该微型拉曼光谱仪的光学设计采用了交叉狭缝共焦概念（如图4a和图4b），可进行共焦测量。该微型化拉曼显微镜是目前所报道的最小的共焦拉曼系统，其设计并未牺牲拉曼系统的基本性能。下面介绍了两种具有挑战性的拉曼显微镜应用，这些应用通常需要使用配备深度制冷传感器的科研级系统。
图4 用于生物医学拉曼显微镜应用的微型化拉曼系统
应用实例四：通过SERS映射定量抗癌药物。研究结果表明，采用配备深度制冷EMCCD的科研级拉曼显微镜进行SERS映射的纳米柱辅助分离（NPAS）方法，可以在5 ~ 150 μM的线性范围内测量PBS中的MTX，检测限为5 μM，定量限为25 μM。研究人员还使用NPAS方法对SERS芯片表面进行SERS映射（如图4g）。
应用实例五：体外细菌鉴定。在这方面，仅需一个步骤，拉曼光谱有望实现快速、无标记、无培养的鉴定和抗菌药敏试验（AST）。本实验中，研究人员使用该微型化拉曼显微镜来测量与之前发表报道中完全相同的细菌分离物，当时研究使用了配备深度制冷CCD的科研级拉曼显微镜（如图4n），同时采用了完全相同的样品制备过程和数据分析，测得的不同细菌的拉曼光谱如图4m所示。
综上所述，这项研究的基本策略是围绕拉曼频移和激光强度的内置实时校准，并通过多种数据处理算法辅助来实现拉曼光谱仪的微型化。此外，该微型化策略还包括：降低传感器暗噪声、补偿像素间的QE变化、激光光学隔离以及保持高光谱分辨率。此外，该研究的微型化策略还提供了宝贵的移频激发差分拉曼光谱（SERDS）和空间偏移拉曼光谱（SORS）功能。与典型的手持式拉曼设备相比，该光谱仪在光谱分辨率、信噪比、操作准备时间、波数和强度校准精度等大多数重要参数上均有改进。此外，该微型光谱仪的整体性能可与高端台式拉曼光谱仪和显微镜相媲美。该研究方法提供的高性能和广泛适用性便于其简单集成到各类仪器和多种应用中。
论文链接：
https://doi.org/10.1038/s41467-024-47044-7
