据麦姆斯咨询介绍，适应性实验室进化（ALE）可用于降低细菌对氧化应激的敏感性。基于微流控技术的ALE平台具有经济和高效的优势，但许多微流控ALE平台都存在细胞传代机制不佳和空间清晰度差的问题。
基于此，近期，来自美国康奈尔大学（Cornell University）的研究人员提出了一种基于微流控芯片的适应性实验室进化（EVoc）新方法，该方法逐渐将微生物细胞从H₂O₂浓度较低的区域驱动到浓度较高的区域（图1）。鼠李糖乳杆菌GG是一种经常在食品中使用的有益益生菌，在该微流控平台上执行ALE后，鼠李糖乳杆菌GG在高H₂O₂浓度下持续存活。经过两次渐进暴露后，鼠李糖乳杆菌在H₂O₂存在下的生长能力提升。与野生型相比，适应性菌株具有不同的形态和基因表达，基因组测序揭示了蛋白质omega-amidase存在潜在的单核苷酸突变。相关研究成果以“Adaptive Laboratory Evolution of Probiotics toward Oxidative Stress Using a Microfluidic-Based Platform”为题发表在《Small》期刊上。
益生菌的ALE及其对H₂O₂耐受性的评价
研究人员使用EvoC平台促进适应性进化，并选择耐H₂O₂的鼠李糖乳杆菌，在EvoC系统中以0、1、2、3至4 mM的浓度暴露于H₂O₂，总共72小时（图 2a）。24小时后，只有第一个生物反应器（S1 - 0 mM）显示出可见的生物质生长，表明该菌株尚未适应较高水平的H₂O₂。然而，在长时间暴露（72小时）后，尽管最后两个生物反应器（S4 - 3 mM和S5 - 4 mM）中的生物量似乎小于前三个生物反应器中的生物量，但在所有生物反应器中都观察到生长。
接下来，研究人员使用生长曲线来评估从EvoC中提取的进化适应性菌株对测试的H₂O₂水平的耐受性变化。从每个生长室中收获细胞，并将它们静态暴露在96孔板中不同水平的H₂O₂中。对从生物反应器中收获的所有五个样品的浓度进行标准化，然后将其暴露于含有H₂O₂的0、1、2、3和4 mM的MRS中48小时，并使用BioScreen系统测量它们的光密度（图2b）。当没有受到压力时，所有样品的生长速度与野生型相同。总的来说，观察到适应性菌株表现出对H₂O₂的耐受性增加。随着H₂O₂浓度的增加，适应性菌株中还观察到了生长起始时间的减少。
抗氧化活性的变化
乳酸菌缺乏有助于分解H₂O₂的过氧化物酶，但会产生抗氧化剂。因此，可以使用成熟的测定法来测量它们的抗氧化活性，例如氧自由基吸收能力（ORAC）测定法，该测定法可量化这些细胞对荧光素的保护，使其免受AAPH的攻击（图3a）。也可以使用ABTS•+测定可量化细胞对ABTS•+自由基的猝灭（图3b）。在这两种测定中，观察到适应性菌株比野生型具有更高的抗氧化能力，并且适应性菌株中TE的增加与H₂O₂暴露水平之间存在线性关系（图3a、b）。
ALE过程中的基因类型变化
为了检验获得性耐受性是否是遗传适应的结果，研究人员使用全基因组测序来检测野生型和适应株之间可能的单核苷酸多态（SNP）。在yafV基因末端发现了一个单核苷酸突变，该基因编码蛋白omega-amidase。这种突变导致了显著的氨基酸变化，其中WT中的疏水色氨酸被适应株中该基因第222个氨基酸残基上的极性精氨酸取代（图4a）。当使用ColabFold和嵌合体X对蛋白质进行可视化时，看到突变发生在蛋白质表面的一张Beta-Sheet上。这种氨基酸的变化导致了局部电荷分布的变化，这可能会影响突变蛋白质的功能（图4b）。与AlphaFold预测的WT蛋白相比，突变蛋白没有任何构象变化。
除了比较SNP的基因组外，研究人员还检查了与氧化应激耐受相关的基因表达水平的变化。具体地说，观察了耗氧酶NADPH氧化酶（NOx）和丙酮酸氧化酶（POx）以及谷胱甘肽（GSH）和硫氧还蛋白还原酶（TRX）的表达，这些酶是维持细胞动态平衡的重要氧化还原修复系统的一部分。观察到所有四个与氧化应激相关的基因都有剂量依赖性的过度表达（图4c）。这些基因的表达增加导致一些益生菌菌株的氧化耐受性提高。
综上，在这项研究中观察到，在EVoC上逐渐暴露于H₂O₂导致野生型鼠李糖乳杆菌适应并在以前无法耐受的条件下持续存在。此外，所有H₂O₂水平的滞后时间减少了10个小时。这是对野生型鼠李糖固有耐受性的改善。这种耐受性的改善与细胞抗氧化活性的提高和参与氧化应激耐受的基因的mRNA表达增加有关。最后，记录了一个单核苷酸突变，这改变了该蛋白质表面的局部电荷分布。需要进一步的研究来充分了解这种突变对观察到的H₂O₂耐受性的作用。该研究表明，EVoC平台成功地在鼠李糖乳杆菌上进行了小规模的ALE，从而为进一步研究用于ALE的微流控平台提供了概念证明。EVoC可用于额外的ALE实验，并可作为研究细菌适应、耐受性和对包括抗生素在内的各种应激源的耐药性的平台。
