单颗粒低温电子显微镜（cryo-EM）可以重建不同构象蛋白质的高分辨率结构。蛋白质的功能通常涉及瞬时功能构象，这可以通过时间分辨冷冻电子显微镜（TrEM）来解析。在TrEM中，蛋白质溶液在电磁栅格上快速玻璃化，经过规定的延迟时间后反应停止。尽管冷冻电镜界对TrEM的兴趣与日俱增，但制作时间分辨率低于100毫秒的TrEM样品仍具有挑战性。
近期，来自比利时佛朗德生物技术研究院的Rouslan G. Efremov团队报告了一种时间分辨冷冻柱塞的设计与实现，该柱塞将基于液滴的微流控混合器与激光诱导的微射流发生器结合在一起，可快速启动反应并冷冻电磁栅。对GroEL:GroES合子蛋白复合物进行的TrEM实验解析了复合物形成的动力学过程，并观察到了GroEL-ATP复合物的假定的短寿命构象。相关工作以“Time-resolved cryo-EM using a combination of droplet microfluidics with on-demand jetting”为题发表在国际顶级期刊Nature Methods上。
在微流控芯片中（图1），两种水溶液在油相中混合并封装成体积约为100 pL的微液滴。液滴中的成分通过混沌平流进行混合，在液滴通过缠绕通道时，混沌平流得到加强。该研究发现，在由三圈组成的蛇形通道中，混合效率超过50%。在液滴合并产生喷雾时，混合在芯片下游完成。为了最大限度地减少喷洒在电磁栅上的油量，使用柱状液滴合并模块将水相液滴合并成连续流，从而将水相和油相分离到不同的通道中。混合水溶液被导入喷嘴，通过激光诱导空化（LIC）产生气悬液滴。聚焦在喷嘴旁微流控通道上的脉冲激光被溶解在水相中的染料吸收，产生大量寿命为微秒的气泡。气泡的膨胀和崩溃导致半月板快速摆动和液体喷射。LIC具有局部驱动的优势：在保持微流控芯片设计简洁性的同时，可通过改变激光功率和频率对过程进行调谐。该研究发现，当使用浓度高于8 mM的苋菜染料时，脉冲Q 开关Nd:YAG 激光器（WL 532 nm，6 ns）在每个脉冲和每个焦点的激光功率为4 μJ ~ 10 μJ时可产生稳定的喷雾。生成液滴的速度在3至6 m/s之间。
在EM网格图谱上观察到的液滴数量与预期的喷射微射流数量一致（图 2），并且随着柱塞时间的增加而增加，因为网格在喷嘴前停留的时间更长（图1e）。该研究对22个骤降网格的分析表明，约65%被喷雾润湿的网格方格的冰区对电子部分透明，允许电子束穿透冰层厚度而不被完全衰减，30%被润湿的方格的区域可用于低温电子显微镜数据采集。该研究观察到，液滴在等离子体清洗过的碳孔网表面迅速扩散，但许多孔仍然是空的。该研究认为这种效应是由于液滴在孔上扩散时产生了额外的表面能量，而使用支撑膜可以减轻这种效应。在测试了几种支撑膜后，发现刚经过等离子体清洗的栅格上多了一层2 ~ 3纳米厚的碳膜，从而改善了液滴的扩散，并将适合冷冻电镜数据采集的孔的数量增加了2 ~ 3倍。冰的厚度小于100 nm的区域出现在柱塞时间在3到200毫秒之间的网格上。每个网格收集了几百到几千张高对比图像。在每个时间点，从两个EM网格收集低温电子显微镜数据，并重建阿朴铁蛋白和β-半乳糖苷酶的三维（3D）图，其分辨率在2.1至3.3 Å之间。
在分辨率介于2.2和7.1 Å之间的情况下，该研究共进行了15次重建（图3和 4），其中包括6种物质。在其中的三种复合物（GroEL-ATP、GroEL-ATP- GroES和GroEL-ATP-2GroES）中，结合核苷酸的磷酸化状态得到了明确的解析。在其它三种复合物，即GroEL-(ADP)、GroEL-(ATP)/(ADP)和GroEL-ATP/(ADP)-GroES中，GroEL七聚环的构象与ATP和/或ADP结合的状态相对应；然而，由于分辨率有限，结合核苷酸的磷酸化状态不明确。所有时间点的数据质量都很高，不仅能进行高分辨率重建，还能进行三维分类，并分离出仅含4%颗粒的小群体。有趣的是，由于在50毫秒和200毫秒时，GroEL-ATP复合物所占的颗粒比例高于20秒时，因此从时间分辨数据中获得的重建分辨率（2.7和2.3 Å）高于从连续周转数据中获得的分辨率（2.8 Å）。TrEM重建显示了构象格局是如何随着反应的进行而发生变化的（图3）。在短反应时间（13毫秒和50毫秒）内，GroEL-ATP 复合物是主要形式，但GroEL-(ADP)和GroEL-(ATP)/(ADP)复合物也被解析出来，这些可能代表在形成GroEL-ATP构象过程中的短暂状态。尽管这些重构的分辨率有待提高，以明确解析结合核苷酸的磷酸化状态，但它们清楚地解析了GroEL七聚环的类ATP和类ADP构象，核苷酸结合袋含有与结合核苷酸一致的密度（图4b）。
在该研究中，与GroEL结合的核苷酸密度在所有重构中都得到了明确的解析。更具体地说，在13毫秒时间点的GroEL-ATP状态下，ATP分子的构象（包括一个腺嘌呤环、三个磷酸基团以及配位的Mg²⁺和K⁺）得到了很好的解析，而从50毫秒开始，该研究在分辨率介于2.3和2.8 Å之间时获得的重构也解析了ATP结合口袋中的水分子（图4a）。这些结果凸显了该方法在毫秒级时间尺度上研究小分子与蛋白质相互作用的实用性。有了反应时间范围内的构象分布，就可以分析GroEL-GroES复合物形成的动力学（图 4c）。GroEL-GroES和GroEL-2GroES复合物的比例分别从50毫秒时的5%和0%增加到20秒时的约24%和65%。组装始于GroEL-GroES复合物的形成，随后加入第二个GroES七聚体。在200毫秒到20秒之间，复合物的比例出现大幅增加，这与FRET实验估计的GroEL-GroES复合物形成的预期速率一致，即在亚秒级范围内。该研究还通过将GroEL与ATP和GroES混合收集了13毫秒的数据，结果证实在这一较短的反应时间点，GroEL-GroES 复合物的比例较低（约为5%）。
综上所述，该研究介绍了一种用于制备时间分辨冷冻电镜网格的仪器的设计、实现和验证。它建立在皮升液滴微流控混合器和LIC按需生成可调微射流的优势之上。这种方法解决了其他用于时间分辨冷冻电镜的样品制备方法的局限性，减少了样品消耗，提高了制备的冷冻电镜网格的可重复性，同时保持了较高的时间和空间分辨率。
