定制化的液滴组装技术，用于大规模表征细胞相互作用

液滴组装用于研究细胞间相互作用

液滴微流控技术能够高通量实现单细胞分析（如蛋白质组学，基因组学等），但是目前难以拓展到单细胞之外。例如，将两个细胞和检测组分结合在同一个液滴中，来表征细胞间相互作用（图1A）。主要原因在于液滴微流控是依靠随机包裹来构建这样的有序组合，效率较低。MODE组装则可以通过使用介电电泳分选来选择和合并单组分液滴。通过快速灵活的分步、确定性过程来构建多组分液滴，从而克服了低效率的问题（图1A）。除了确定性的组成，MODE液滴与其他方法形成的液滴相同，因此，可以兼容常规的操作，如孵育以允许细胞-细胞相互作用发生（图1B），进一步荧光分析、分选和测序以表征相互作用行为（图1C）。

图1 液滴组装用于研究细胞间相互作用

液滴的精确组装

为了评估精确液滴组装的可行性，研究人员生成了含有可控数量荧光微球的液滴（图2A）。通过荧光显微镜评估每个液滴中微球的分布，结果表明编程液滴包含两个、三个、四个或五个微球的精度分别为92%±2.1%、88%±1.0%、78%±3.1%和75%±7.2%（图2A）。虽然组装效率随着微球的增加而降低，但是即使在5颗微球时，该装置的组装效率也可以达到75%，远高于传统基于泊松分布的液滴组装效率。MODE在组装包含不同类型细胞的液滴实验中，为了保证将一定数量的细胞正确分配到组合液滴中，研究人员采用绿色、橙色和红色荧光染料标记不同的Raji细胞，以区分不同的细胞类型，并构建了3000个MODEs，其中每个类型的细胞恰好包含一个（图2B-D）。组装的正确率可以达到82%，缺失一个细胞的比例为10%，包含一个额外的细胞的比例为8%（图2E-2F）。

图2 液滴的精确组装

大规模表征CAR-T激活

CAR-T细胞疗法的原理是改造人体的天然T细胞，使其表达一种受体，这种受体能够特异性地识别激活T细胞的癌细胞，并产生免疫反应，治疗疾病。CAR-T工程学的一个重要部分是鉴别能够特异性高效杀死癌细胞的CAR-T细胞。然而，目前实现该目标的bulk细胞方法，无法在单细胞分辨率鉴别具有所需性质的CAR-T细胞，并且成本高昂，需要多轮测试和筛选。相反，MODE组装通过单独测量CAR-T与癌细胞孵育时的激活情况，提供了一种有效鉴别CAR-T的方法。

为了鉴定激活细胞，研究人员首先构建了具有荧光重定位检测体系的MODEs，用于检测分泌干扰素-γ（IFN-γ）。包被有捕获抗体的检测微球用于捕获IFN-γ，IFN-γ被荧光二抗结合后产生富集信号（图3A）。研究人员使用人工刺激的外周血单个核细胞（PBMCs）测试了方法的可行性和通量（图3B）。使用MODE组装，研究人员构建了包含佛波酯13-乙酸酯（PMA）/离子霉素激活PBMC的液滴。结果表明该方法可以实现82%的完整组装精度（图3C和D）。孵育14h后（图3E），将MODE液滴重新注射到液滴分选体系中，发现有17.9%的液滴中分泌IFN-γ（图3F），这与之前PMA/ionomycin刺激PBMC分泌IFN-γ的结果一致。

图3 大规模的单个细胞分泌IFN-γ事件分析

研究人员接下来富集与癌细胞相互作用时激活的CAR-T细胞。研究人员组装了16000个MODEs，其中包含CAR-T细胞、Raji细胞、IFN-γ检测微球和检测试剂。另外，研究人员制备了10000个MODEs作为阴性对照，包含两个CAR-T细胞和检测试剂，但没有Raji细胞。孵育14h后，研究人员在CAR-T+Raji MODEs中检测到激活的CAR-T细胞，而在同型对照中没有检测到激活的细胞（图4A-4B）。 为了富集激活的细胞，研究人员根据荧光阈值（图4B）对阳性和阴性液滴进行分选。破乳回收液滴中的内容物，并分析微球的荧光强度，结果表明阳性液滴的信号相对于未分选的液滴有5.5倍富集，相对于弃掉的液滴有18.3倍富集（图4C）。为了揭示激活行为的分子机理，研究人员对分选后收集的细胞和弃掉的细胞进行单细胞RNA测序。比较了两个细胞群之间的整体基因表达后，发现granzyme（GZMB），一种与活化的CD8+ T细胞相关的丝氨酸蛋白酶，在分选群体中显著上调。使用GZMB作为激活的标志，研究人员进一步比较了在分选和弃掉细胞群中，表达GZMB的细胞与在弃掉细胞群中不表达GZMB的细胞，两者的基因表达差异（图4D）。

图4 检测CAR-T细胞间相互作用以及富集激活细胞

综上所述，该研究报道了一种用于分析细胞间相互作用的高通量技术，该技术将介电电泳液滴分选与确定性液滴融合集成，从而能够构建包含试剂、微球和细胞的特定组合的多组分液滴。基于该方法，研究人员进一步富集了与癌细胞孵育后激活的CAR-T细胞，并鉴定了相关基因表达，为突破T细胞治疗的瓶颈提供了可选择的方法。