霉菌试验

一、概述

霉菌是在自然界分布很广的一种微生物，它广泛存在于土壤、空气中。

霉菌试验是气候环境试验中的一个项目，用于考核产品或材料抵抗霉菌侵蚀的能力。它与一般环境试验一样，选择产品在实际运输、存储或使用过程中最易遭受霉菌危害的环境条件，在实验室中用人工模拟的方法创造该环境条件并进行试验。

霉菌试验用于确定：

（1）设备或组件是否长霉；

（2）霉菌在设备上的生长速度；

（3）霉菌在设备上生长后对装备及其任务完成和使用安全性的影响；

（4）设备能否在环境中有效存储；

（5）若有霉菌生长，有无简单的去除方法。

霉菌试验是确保设计和制造的设备符合防霉要求的最有效手段。尽管设计时已考虑使用防霉材料，但往往不可能完全避免长霉，必须进行霉菌试验，检验其是否真正符合要求。对于尚在研制过程中的产品，霉菌试验的结果可作为改进产品耐霉菌设计的依据，对于设计定型的产品，霉菌试验可作为产品是否符合设计要求、是否能通过设计定型的一个依据，当然也可为日后的改进设计提供信息。

为确定产品抗霉菌侵蚀的能力，必须制定一个与实际工作条件相似并能判断霉菌的侵蚀作用及给出正确评价的试验方法。为产品的选材、结构和设计提供依据，以保证产品能在有大量霉菌存在的气候环境中安全可靠地运行。

二、霉菌试验的标准

1.霉菌试验的标准

目前，许多国家都制定了霉菌试验标准。这些标准基本上分为 3 个类型，第一类是明确只用于设备一级的标准，第二类是明确只用于材料一级的标准，第三类是设备和材料混用的标准，具体如表1所示。

表1 国内外霉菌试验标准及其比较

2.霉菌试验标准适用性

由于霉菌试验目的不同，适用的试验方法也不相同，GJB 150 及 MIL-STD-810E 明确指出，该试验是要得到设备对霉菌的敏感性数据，不能用于基本材料的试验。材料的长霉试验可用更为严酷的其他方法，如温床土埋、纯净培养、混合培养和培养皿等进行。从表2-43中可以看出，除 MIL-STD-810 和 GJB 150 以外，还有美国 RTCA DO 160C，我国的 HB 6167、HB 5830，国际电工委员会IEC 68-2-10A号出版物，GB 2423、英国标准DEF STAN 07—55、法国标准AIR 7304、俄罗斯国家标准ΓOCT 20.57—406等均适用于设备一级。这些标准实际上可进一步分为美国和欧洲两个体系，美国标准体系均是采用 5 个菌种，而欧洲体系采用 8 个菌种。试验的其他参数差异不大。俄罗斯标准的特别之处是规定也可用于设备和材料的霉菌试验。HB 5830制定时受到GB 2423的影响，也做了适用于材料试验的规定。

各国也有一些专门用于材料的霉菌试验标准，如美国标准 AST M3273、日本标准JIS 2911、GB 1741 等，这些标准在试验菌种、培养方式、试验条件及试验时间等方面均与MIL-STD-810E规定的不同，如风速一般在0.2m/s以下，总体来说，其试验条件要比设备试验方法标准严酷。

尽管材料的霉菌试验一般采用培养皿法，且试验条件要比设备试验严酷，但材料霉菌试验并不能取代设备的霉菌试验，因为即使设备使用了各种通过霉菌试验的材料，但由于用这些材料制成的设备，结构难免会积水或藏尘，且在制造过程中会受到各种污染，因而仍然会长霉和受到各种霉菌的侵蚀，故有必要进行GJB 150和MIL-STD-810E规定的实验室试验或自然环境试验来验证设备的抗霉能力。由于实验室试验是用工程简化方法进行的试验，用它对设计不良或选材不合适的设备进行试验时，虽然可以得到组成该设备的材料长霉情况的一些有用信息，但不可能找到其使用中可能遇到的所有故障源。

三、霉菌试验的方法及技术

1.试验方法

本文主要介绍 GJB 150.10A—2009《军用设备环境试验方法霉菌试验》标准的试验方法及实施步骤。

本试验涉及高度专业化的技术，并含有具有潜在危害的微生物。只有具备专业技术资格的人（如微生物专家）才能进行本试验。进行本试验所需的安全性信息见GB/T 2423.16—1999。

1）限制

本试验不适用于基体材料的检测，基体材料的检测应采用其他材料检测方法，如土埋、纯培养、混合培养平板试验等方法。

2）选择试验方法

分析有关技术文件的要求，应用产品订购过程中实施GJB 4239得出的结果，确定设备寿命期内霉菌生长环境出现的阶段，根据下列环境效应确定是否需要进行本试验。当确定需要进行本试验，且本试验与其他环境试验使用同一试件时，还需确定本试验与其他试验的先后顺序。

3）特殊要求

本试验一般不适宜在事先做过盐雾、砂尘湿热试验的试件上进行。如果需要，可在盐雾或砂尘试验前做霉菌试验。大量聚集的盐分会影响霉菌的发芽和生长，而砂尘能为霉菌提供养分。因此，可能对试件的生物敏感性造成假象。

4）选择试验程序

本试验只有一个程序。由于温度和湿度的组合对微生物的生长很关键，因此，应按照本试验的规定保持试验时的温、湿度条件。

5）确定试验条件

（1）试验持续时间

霉菌试验的最短持续时间为 28 天（霉菌发芽、分解含碳分子及降解材料的最短时间是28 天）。由于长霉对试件产生的间接侵蚀和物理影响不可能在较短的试验持续时间内出现，如果要求在确定长霉对试件的影响方面需要提高确定度或降低风险时，则应考虑将试验时间延长至84天。

（2）霉菌菌种选择

表2中列出两组常用的霉菌菌种。试验时应选择其中一组，如需要还可以对菌种进行调整。这些菌种是按照对其材料的降解能力、在地球上的分布状况及其本身稳定性来选定的。表2中所列菌种都相应表明了侵蚀的材料种类，如有需要可在已选定其中一组菌种的基础上额外增加菌种。

· 试件在试验前无须灭菌，试件表面可能存在其他微生物。试验期间这些微生物会与试验菌种争夺养分。因此，试验结束时试件上可能会有非试验用菌种的生长。

· 可在试验要求的菌种中加入其他霉菌菌种。增加的菌种应按其对材料的降解情况来选择。

表2 试验可选用的菌种组别何种类

2.试验信息要求

1）试验前需要的信息

（1）菌种组的选择。

（2）要增加的菌种。

（3）试件是否清洁及清洁方法。

2）试验中需要的信息

（1）记录随时间变化的试验箱温度和相对湿度。

（2）在7天时检查棉布对照条上霉菌生长情况的记录。

3）试验后需要的信息

（1）试验结束时霉菌生长情况的记录。

（2）描述霉菌的生长情况，包括颜色、覆盖面积、生长形式和生长密度（若可能则拍照），如表3所示。

（3）霉菌对试件性能或使用的影响如下：

① 试件从试验箱取出时的情况；

② 在去除霉菌后的情况（若适合）；

③ 生理或审美的考虑。

（4）有助于故障分析的观察资料。

表3 外观影响的评定

3.试验要求

1）试验设备

（1）试验箱

试验箱和附件的结构应防止冷凝水滴落在试件上。试验箱通过带过滤功能的通气孔与大气相连，既能防止试验箱内的压力增大，又能防止向大气排放霉菌孢子。

（2）传感器

使用不受冷凝影响的湿度测量系统或传感器来检测和控制试验箱内的湿度。控制试验箱环境的传感器与记录湿度和温度的传感器应分开。

（3）风速

流经湿度传感器的风速至少为 4.5m/s。流经试件和对照条附近的风速应控制在 0.5～1.7m/s。如果需要，则在试件周围安置折向装置或滤网。湿度传感器应安装在不受风扇发动机热影响的地方。

2）试验控制

（1）相对湿度

应使用不受水冷凝影响的固态传感器或等效的方法（如快速响应的干湿球传感器）测定相对湿度，不要使用对冷凝敏感的氯化钾传感器，同时还要注意：

① 当使用湿球控制方法时，清洁湿球组件，每次试验都装上新纱布条；

② 为了在传感器上获得测量湿球温度所必需的蒸发，应确保流经湿球的风速不小于4.5m/s；

③ 因为来自风扇发动机的热可能影响温度读数，因此，不要在靠近用于满足要求的风扇或送风器的散热处安装湿球和干球传感器。

（2）空气流通

保持空气在试件周围的自由流动，并使支撑试件的支架与试件的接触面积维持最小。

（3）水汽

不要将水汽直接导入试验箱工作空间内，因为它对试件和微生物活性肯可能产生不利影响。

（4）试剂和水

本部分试验所用试剂和水的要求如下：

① 使用合格的试剂。

② 本部分提到的水均指符合GJB 150.1A—2009中3.2规定的蒸馏水或相同纯度的水。

3）试验中断

与其他环境试验不同，霉菌试验涉及活的微生物。如果试验中断，应考虑涉及活性微生物的实际情况。

如果中断出现在试验的最初10天，则使用新的试件或清洁过的相同试件重做实验。

如果中断出现在试验的后期，则检查试件长霉的情况。若试件已长霉，则不必重新试验；若棉布对照条存在活菌，但无迹象显示试件长霉，则按下面给出的指导进行处理。

（1）温度降低。试验箱的温度降低一般会延缓霉菌生长。如果相对湿度不变，则重新建立试验条件，然后从温度降低到规定允差之下的时间点继续试验；否则，按（3）的规定执行。

（2）温度升高。升高的温度可能会显著影响霉菌的生长。如果下列其中一条出现，则要求从头开始重新试验，否则重新建立试验条件并从中断点处继续试验。

① 温度超过40℃。

② 温度超过31℃达4h或以上。

③ 在对照条上生长的霉菌出现衰退。

（3）湿度降低。如果下列其中一条出现，则从头开始重新试验，否则重新建立试验条件并从中断点处继续试验。

① 相对湿度低于50%。

② 相对湿度低于70%达4h或以上。

③ 在对照条上生长的霉菌出现衰退。

4）去污染

暴露于霉菌试验后的试验设备和试件应进行去污染处理。

4.试验过程

1）试验准备

（1）试验前准备

试验开始前，根据有关文件确定试件的技术状态、持续时间、菌种、存储/工作的参数量值等。

（2）试件预处理

最好用新的试件，也可用做过其他试验的试件。若要求清洁试件，则应在清洁完成后至少72h再开始试验，以使发挥物质蒸发。清洁试件采用典型的方法。

（3）试验中灭菌处理

霉菌试验中的灭菌也是保证试验结果重现性的一个重要因素。灭菌的彻底与否直接影响试验结果的准确度。若霉菌试验灭菌不彻底，则会造成判别上的失误，影响试验结果，造成不必要的浪费。

霉菌试验的灭菌主要分为 3 个阶段：对试验前准备工作所用到的玻璃器皿、仪器、使用的工具（如刀、剪、接种针等）进行灭菌；喷菌前，对试验空间、设备进行灭菌；试验结束后对所有用过的器具、物品都要进行灭菌。

灭菌方法主要有热力灭菌、化学灭菌、物理灭菌。3 种方法在一个试验过程中往往是交叉使用。一般对孢子悬浮液、菌种、培养基等采用热力灭菌；对环境及试验设备、仪器，则化学和物理灭菌并用，以便彻底灭菌。

（4）指导信息

下列指导信息有助于实施本试验。

① 应选择对装备上多数材料具有侵蚀能力的菌种组。如果需要，可以添加其他菌种。

② 应由专业人员在专业实验室内进行。

③ 孢子发芽和生长需要潮湿环境。当环境空气的湿度超过 70%时，霉菌孢子开始发芽和生长；相对湿度高于这个数值时，如90%～100%，霉菌的发芽和生长还会变得更快。

④ 棉布对照条用于：

· 验证接种液中所用霉菌孢子的活性；

· 验证试验箱内的环境适宜霉菌生长的程度。

⑤ 材料和部件的霉菌试验不能完全代表其所构成装备的霉菌生长情况，因此，如需要产品长霉的全面信息，应用整机进行本实验。

⑥ 菌种保藏在6℃±4℃不超过4个月，在此期间应再进行接种并作为新的保藏菌种。

⑦ 每次试验最好使用新鲜制备的孢子悬浮液。若孢子悬浮液不是新鲜制备的，则其在6℃±4℃保藏时间不超过1天。

（5）无机盐溶液的制备

使用清洁器皿，按表4制备无机盐溶液，并使溶液的pH值保持在6.0～6.5。

表4 无机盐溶液成分

（6）混合孢子悬浮液的制备

混合孢子悬浮液制备的要求与过程如下：

① 使用无菌技术制备至少包含规定的试验菌种的孢子悬浮液。

② 将纯菌种分别培养在合适的培养基上（如马铃薯葡萄琼脂），而球毛壳霉应在无机盐琼脂表面的滤纸上进行培养。无机盐琼脂的配制方法如下：将15.0g琼脂溶解在规定的1L无机盐溶液中。

③ 试验前检查菌种的纯度。

④ 制备保藏纯菌种的次级培养菌种，并在30℃±1℃培养10～21天。

⑤ 向每种次级培养菌种的试管中注入每升含0.05g无毒润湿剂的水溶液10mL。

⑥ 用无菌玻璃圆棒、铂丝或镍铬丝在试验菌种的表面轻刮。

⑦ 将孢子提取液注入 125mL 带盖锥形瓶，瓶内装 45mL 水、50～70 粒直径为 5mm 的实心玻璃球。

⑧ 剧烈振荡锥形瓶，以打碎孢子，从菌丝体中释放出来。

⑨ 用装有 6mm 厚玻璃棉的玻璃漏斗，将霉菌孢子悬浮液过滤到锥形瓶中，以去除打碎的菌丝体碎片和琼脂块。

⑩ 将过滤后的孢子悬浮液离心，弃掉上层液。在剩余物中加入50mL水重新悬浮并离心。将获得的每种霉菌孢子至少以这种方法离心3次（直到上层液变清）。用无机盐溶液稀释已离心的最后剩余物，通过计数器计算，最终使得每升孢子悬浮液含有1000000×（1±20%）个孢子。对试验用的每一种菌种孢子进行活力检验。将相等容积的每种孢子悬浮液混合，得到最后的混合孢子悬浮液。

（7）验证试验

本试验应进行两种验证试验，以检查孢子悬浮液的活力，以及试验箱环境是否适合霉菌生长。

孢子悬浮液的活力试验步骤如下：

① 在制备混合孢子悬浮液前，将 0.2～0.3mL 的每种霉菌孢子悬浮液分别接种在无菌的马铃薯葡萄糖或其他琼脂平板上，每种菌种使用单独的琼脂平板。

② 将接种液涂于琼脂平板的整个表面。

③ 接种后的琼脂平板在30℃±1℃的培养箱内培养7～10天。

④ 培养结束后检查霉菌的生长。

任何一种试验菌种在各平板的整个表面没有出现大量生长，都证明使用这些菌种孢子所进行的试验无效。

试验箱内环境试验步骤如下：

① 按规定制备溶液，并用HCl和NaOH调节最终溶液的pH值到5.3。

② 将未漂白的普通100%棉布剪成约3cm宽的长条制备对照条。只使用不含防霉剂、憎水剂和浆料添加剂的棉布条。去除棉布条上的任何处理材料，建议将其用蒸馏水煮沸，然后将棉布条浸入表5所示的溶液中，应确保棉布条已彻底湿润，浸透后除去棉布条上的多余液体，在放入试验箱接种前悬挂晾干。

③ 在试验箱内将对照条靠近试件垂直悬挂，确保对照条和试件经受相同的试验环境。对照条的长度至少要与试件的高度相等。

④ 为了确保试验箱内的正确条件以促进霉菌生长，应放置 3 件对照条并和试件一起接种。

表5 溶液成分

（8）初始检测

试验前所有试件均需在标准大气条件下进行检测，以取得基线数据。检测应按以下步骤进行。

① 记录试验室内的大气条件。

② 对试件进行全面的外观目视检查，记录检查结果（若需要，可照像）。

③ 如需要，按技术文件的要求对试件做工作性能检测，并记录检测结果。若试件工作正常，则继续进行后续的试验程序；若试件工作不正常，则应解决问题，并重新对试件进行初始检测，直到正常为止。

2）试验程序

试验程序按以下步骤进行：

（1）将试件按照要求的技术状态安装在试验箱内合适的支架上或进行悬挂。

（2）在接种前将试件放置在工作中的试验箱内（温度为 30℃±1℃、相对湿度为95%±5%）至少4h。

（3）通过喷雾器将混合孢子悬浮液以很细的薄雾喷在棉布对照条上以及试件表面和里面（若非永久密封或气密密封）进行接种。应在对试件有适当了解的人员帮助下暴露试件的内表面并对其进行接种。

（4）为了使空气能进入试件的内部，在复位试件的外壳时不要上紧紧固件。

（5）接种后立即开始试验培养。

在使用混合孢子悬浮液对试件和对照条喷雾时，喷雾要覆盖试件在使用或维修期间暴露的所有外表面和内表面，若表面未湿润，则继续喷雾直到液滴在表面开始形成为止。

（6）除（7）和（8）两个步骤外，在恒定温度 30℃±1℃、相对湿度 95%±5%的条件下进行试验（至少28h）。

（7）在试验 7 天后，检查对照条的霉菌生长以确定试验箱内的环境适合霉菌生长。此时与试件处于同一水平位置的每个对照条应至少有 90%的表面被霉菌覆盖。否则，调节试验箱到所要求的适合霉菌生长的条件后重新开始整个试验。在试验期间对照条留在试验箱内。

（8）若在试验 7 天后对照条 90%以上的表面出现霉菌生长，则继续试验直到试验所要求的时间为止。若在试验结束时与试验 7 天时相比对照条上霉菌的生长没有增加，则说明本次试验无效。

（9）在试验结束时应立即检查试件。如果可能，则在试验箱内进行检查。在试验箱外的检查如果不能在8h内完成，则应将试件放回试验箱内或相似潮湿环境中至少12h。除气密性装备外，应打开试件外壳并检查试件的内部和外部。记录检查结果。

（10）如果试验后要求检测试件（如电子系统）的工作性能，则在（9）规定的检查期间使试件工作。检查时应有对试件有适当了解的人员在场，以帮助暴露试件内部进行检查，以及使试件工作和使用。在工作检查时任何对霉菌生长造成的干扰都必须保持在最小程度。

3）结果分析

除GJB 150.1A—2009中3.17的指南外，下列信息也有助于评价试验结果。

（1）在试件上生长的任何霉菌必须进行分析，以确定霉菌是生长在试件材料上还是生长在污染物上。

（2）在试件生长的任何霉菌，无论来自接种液还是其他来源，都必须由具备资格的人员进行如下评价：

① 敏感元件或材料上霉菌生长的程度，但任何霉菌生长都必须进行完整描述；

② 霉菌生长对装备物理特性的直接影响；

③ 霉菌生长对装备的长期影响；

④ 支持霉菌生长的特定材料（养分）。

四、霉菌试验实施案例

1.案例1

图 1所示的产品为连接器组件，按 GJB 150.10—2009 中菌种组 2 组进行霉菌试验，试验周期为 28 天，试验评定结果为长霉等级 3 级。对产品进行分析，确定主要霉菌中度生长的主要原因是产品选用的热熔胶防霉等级达不到要求。

图1

2.案例2

图 2所示的产品为矩形连接器，按 GJB 150.10—2009 中菌种组 2 组进行霉菌试验，试验周期为28天，试验评定结果为长霉等级2级。

图2

3.案例3

图 3所示的产品为模块电路，按 GJB 150.10—2009 中菌种组 2 组进行霉菌试验，试验周期为 28 天，试验评定结果为长霉等级 1 级。该产品四周及顶部均无霉菌生长，但产品底部选用的白色固封胶体微量长霉，从而影响整个产品的防霉等级。

图3

五、霉菌试验技术的发展趋势

霉菌试验是考核产品或材料抗霉菌能力的重要手段，试验结果的科学性、合理性至关重要。目前霉菌标准给出了一般情况下试验条件的推荐值，如无其他规定，可按照试验程序进行试验，但实际产品在使用过程中经常面对不同的环境。因此，未来霉菌试验应考虑依据产品在实际环境和场所确定不同的菌种、试验温度、试验风速和试验周期来确定试验条件，从而更好地验证产品的环境适应性。

霉菌试验后对长霉颜色、覆盖的面积、生长的形式、生长的密度和分布状态等等等级的评价，基本上是依靠检验人员的经验判断给出结论，人为因素起到很大的作用，试验结果的等级判断差异很大。因此，在试验结果的判定上引入数字显微技术，规范和量化试验结果，减少接触时间，提高判断的准确性。